Cette page correspond à l’analyse des résultats du SNP calling effectué avec mon petit programme phruscle (“phred + muscle”).
Pour rappel, ce programme utilisait phred sur les fichiers de séquençage pour déterminer les bases. Les séquences obtenues étaient ensuite alignées à un alignement de référence composé de la séquence sauvage et de la séquence du gène synthétique.
J’ai ensuite analysé les sorties de phred qui recense la qualité des bases appelées. J’ai pu ainsi attribuer un score de qualité à toutes les bases non chimériques, ie avec une correspondance dans l’alignement de référence et dans le fichier de séquençage.
library(dplyr)
library(ggplot2)
library(readr)
library(viridis)
library(cowplot)
fte_theme <- function() {
## Generate the colors for the chart procedurally with RColorBrewer
palette <- RColorBrewer::brewer.pal("Greys", n=9)
color.background = palette[2]
color.grid.major = palette[3]
color.axis.text = palette[6]
color.axis.title = palette[7]
color.title = palette[9]
## Begin construction of chart
theme_bw(base_size=9) +
## Set the entire chart region to a light gray color
theme(panel.background=element_rect(fill=color.background, color=color.background),
plot.background=element_rect(fill=color.background, color=color.background),
panel.border=element_rect(color=color.background),
panel.grid.major=element_line(color=color.grid.major,size=.25),
panel.grid.minor=element_blank(),
axis.ticks=element_blank(),
## Format the legend, but hide by default
legend.position="none",
legend.background = element_rect(fill = scales::alpha(color.background, 0.3)),
legend.text = element_text(size=7,color=color.axis.title),
## Set title and axis labels, and format these and tick marks
plot.title=element_text(color=color.title, size=14,
face = "bold", vjust=1.25, hjust = 0),
axis.text.x=element_text(size=7,color=color.axis.text),
axis.text.y=element_text(size=7,color=color.axis.text),
axis.title.x=element_text(size=8, color=color.axis.title, vjust=0, hjust = 0.9),
axis.title.y=element_text(size=8, color=color.axis.title, vjust = 0.9, angle = 0 ),
## Plot margins
plot.margin = unit(c(0.35, 0.2, 0.3, 0.35), "cm"))
}
theme_set(theme_bw() + fte_theme())
legend_position <- function(x=NULL, y=NULL) {
if (is.null(x) & is.null(y)) theme(legend.position = "bottom")
else theme(legend.position = c(x, y))
}
data_location <- "../../data/phruscle_snpcall.csv"
snp <- read_csv(data_location) %>%
mutate(
name = gsub("-1073.+$", "", name),
base = toupper(base)#,
)
find_mutant <- function(name) {
if (grepl("ws", name)) "ws"
else if (grepl("sw", name)) "sw"
else if (grepl("W", name )) "w"
else if (grepl("S", name )) "s"
else ""
}
# neat little trick to reduce time of rowwise application of find_mutant.
snp <- snp %>%
group_by(name) %>%
summarise(count = n()) %>%
rowwise() %>%
mutate(mutant=find_mutant(name)) %>%
inner_join(snp, .)J’ai donc obtenu un tableau de donnée de la forme suivante, où :
cons: un code maison pour déterminer le consensus. . si les trois bases sont identiques, x si la base séquencée est la base introduite, X si la base séquencée est la base sauvage, N si c’est encore autre chose.name: le nom expérimental de la séquencerefb: la base de référencerefp: la position sur la référence.seqb: le reverse complement de la base séquencée.seqp: la position sur la séquence expérimentale.snpb: la base sur le gène synthétique introduit.base: la base séquenceé.qual: sa qualité.phase: la position sur le spectrogramme.mutant: ordinal, la manip.head(snp)## Source: local data frame [6 x 12]
##
## cons name refb refp seqb seqp snpb base qual phase count mutant
## (chr) (chr) (chr) (int) (chr) (int) (chr) (chr) (int) (int) (int) (chr)
## 1 x pws1 - 4 G 1 G G 21 312 749 ws
## 2 x pws1 - 4 C 2 C C 25 323 749 ws
## 3 x pws1 - 4 A 3 A A 24 332 749 ws
## 4 x pws1 - 4 T 4 T T 24 343 749 ws
## 5 x pws1 - 4 G 5 G G 29 358 749 ws
## 6 x pws1 - 4 G 6 G G 29 375 749 ws
n_distinct(snp$name)## [1] 381
On a donc bien toutes nos séquences.
snp %>%
group_by(mutant) %>%
summarise(count = n()) %>%
knitr::kable(align = "c")| mutant | count |
|---|---|
| s | 63866 |
| sw | 70173 |
| w | 69390 |
| ws | 71989 |
snp %>%
group_by(mutant, name) %>%
summarise(count = n()) %>%
ggplot(data = ., aes(x = count )) +
geom_histogram(binwidth = 1) +
labs(x = "Nombre de positions", y = "",
title = "Distribution du nombre\nde positions par séquence")J’ai voulu déterminer s’il existe des bases dans les sorties de phruscle qui ne correspondent pas aux sorties de phd. Autrement dit si la base base est bien toujours la même que la base seqb.
FALSE %in% (snp$base == snp$seqb)## [1] FALSE
Plutôt bon signe ! Phruscle a fonctionné comme il faut, ie toutes les bases qu’on a sorties dans nos alignements ont une correspondance dans le fichier phred !.
On regarde globalement la distribution de la qualité des bases :
snp %>%
ggplot(data = ., aes(x = qual )) +
geom_histogram(binwidth = 1)J’ai regardé séquence par séquence les variation de qualité le long de la séquence :
snp %>%
ggplot(data = ., aes(x = refp, y = qual, color = qual )) +
geom_point(alpha = 0.1, size = 0.1) +
geom_line(aes(group = name), alpha = 0.1, size = 0.1 ) +
scale_color_viridis()
Position des bases de qualité < 30
snp %>%
filter(qual < 30) %>%
ggplot(data = ., aes(x = refp, y = qual )) +
geom_point(alpha = 0.1, size = 0.1)Comme attendu, la qualité est moindre en fin de run, et plutôt bonne au début1 On séquence de droite à gauche, la cassette de résistance est à la position avant -1. Ce sont des séquences trimmées par phd. On n’est pas obligé de trimmer. Peut-être refaire les analyses avec les séquences non trimmées.
snp %>%
group_by(name, mutant) %>%
summarise(len = max(refp) - min(refp)) %>%
ggplot(data = ., aes(x = len )) +
geom_histogram(binwidth = 1) +
facet_grid(mutant ~ .)
snp %>%
filter(cons == "x" | cons == "X") %>%
## filter(refp < 750 & refp > 40) %>%
ggplot(aes(x = refp)) +
geom_histogram(binwidth = 1)Une fonction pour faire un alignement des positions d’intérêt, sans avoir à répéter le code deux fois pour sw et ws. J’ai ̉hardcodé’ les limites de la référence basé sur le graphique dans la marge.
plot_align <- function(data, mutant_) {
sort_by_tract_length <- function(mut) {
data %>%
filter(mutant == mut) %>%
group_by(name, mutant) %>%
filter(cons == "x") %>%
summarise(len = max(refp) - min(refp)) %>%
ungroup() %>%
arrange(len) %>%
{.$name}
}
find_polarity <- function(reference, experimental) {
is_w <- function(base) { ifelse(base == "A" | base == "T", TRUE, FALSE)}
is_s <- function(base) { ifelse(base == "C" | base == "G", TRUE, FALSE)}
if (is_w(reference) & is_w(experimental)) "ww"
else if (is_w(reference) & is_s(experimental)) "ws"
else if (is_s(reference) & is_w(experimental)) "sw"
else if (is_s(reference) & is_s(experimental)) "ss"
else ""
}
data %>%
group_by(name, mutant) %>%
filter(
refp < 750 & refp > 57,
mutant == mutant_,
cons == "x" | cons == "X"
) %>%
rowwise() %>%
mutate(sens = find_polarity(refb, seqb)) %>%
ggplot(aes(x = factor(refp),
y = factor(name, levels = sort_by_tract_length(mut=mutant_)))) +
geom_point(aes(color = sens, size = qual, alpha=qual)) +
scale_color_viridis(
discrete = TRUE,
end=0.95
## labels = c("Indel", "S vers S", "S vers W", "W vers S", "W vers W")
) +
scale_alpha(
range=c(1/5, 1),
guide=FALSE
) +
scale_size(
trans = "reverse",
range = c(1, 3),
breaks = c(10, 50),
labels = c("10", "50")) +
labs(
x = "Position sur la référence",
y = "",
color = "Remplacement",
size = "Qualité",
title = paste("Alignement pour la manip", toupper(mutant_))
) +
theme(
legend.position = "top",
legend.margin=unit(-0.3,"lines"),
legend.key = element_rect(
fill = scales::alpha("gray", 0),
colour = scales::alpha("gray", 0)),
panel.grid.major.y = element_line(size = 0.1, linetype = "dotted")
)
}
plot_qual <- function(data, mutant_) {
data %>%
filter(mutant == mutant_) %>%
ggplot(aes(x=refp, y=qual, color=qual)) +
geom_point(size=0.1, alpha=0.1) +
scale_color_viridis(end=0.95) +
labs(x="Position sur la référence",
y="") +
coord_cartesian(xlim=c(50, 730)) +
geom_smooth(se = FALSE, color=viridis(1), linetype="dotted")
}
plot_align_qual <- function(data, mutant_) {
plot_grid(
data %>% plot_align(mutant_),
data %>% plot_qual(mutant_),
ncol=1, rel_heights = c(8.5, 1.5),
align='v', labels=c(" 1", " 2")
)
}snp %>% plot_align_qual("ws")
snp %>% plot_align_qual("sw")
snp %>% plot_align_qual("s")
snp %>% plot_align_qual("w")
## snp %>%
## filter(cons != ".") %>%
## rowwise() %>%
## mutate(sens=find_polarity(refb, seqb)) %>%
## filter(sens != "") %>%
## print(n=100)plot_grid(
snp %>% plot_align_qual("s"),
snp %>% plot_align_qual("w"),
snp %>% plot_align_qual("ws"),
snp %>% plot_align_qual("sw"),
labels=c("A", "B", "C", "D"), ncol=4
)